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导师不教!仅需 4 步,15 分钟就能分离出高纯度 PBMCs

人阅读 发布时间:2024-05-28 14:21

外周血单个核细胞 (PBMC) 的传统分离通常费时费力,其首先需要使用密度梯度离心液使血液缓慢分层,然后在关闭刹车的情况下进行30分钟的长时间离心,并使用移液管小心地收集 PBMC。一般来说,整个过程大概需要60分钟左右,并且加样过程需要格外小心以避免样本与密度梯度离心液混合。

STEMCELL的 SepMate™ 密度梯度离心管 可以在短短 15 分钟内快速、高效地从全血中分离 PBMCs。SepMate™ 离心管包含一个特殊插件,将血液与离心液分隔开,离心后具有明显的分层,只需要简单倾倒便能收集到高质量的 PBMC。

本期 STEMCELL 将详细阐述使用 SepMate™ 密度梯度离心管从血液中分离单个核细胞的具体实验方案,希望能对您的实验有所帮助。现可免费申请 SepMate™  密度梯度离心管试用(点此申请试用)

所需耗材及试剂

  • 全血样本

  • 密度为1.077 g/mL的密度梯度离心液(如Lymphoprep™,产品号 #07801)

  • 含2%胎牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS + 2% FBS,产品号 #07905)或其他合适的培养基

  • SepMate™离心管

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图1 SepMate™分离单个核细胞的流程图

实验方案

第一部分:样品准备

使用适当的抗凝剂(例如酸性柠檬酸葡萄糖[ACD]或肝素)收集全血。在使用 SepMate™ 之前,全血样本可在室温 (15 - 25°C) 下保存不超过 48 小时。使用适当的抗凝剂(例如ACD或肝素)收集骨髓。在使用SepMate™之前,骨髓样本在室温下保存的时间不得超过48小时。

 

第二部分:使用 SepMate™ 分离PBMCs

确保样品、推荐培养基(PBS + 2% FBS)、密度梯度离心液和离心机均处于室温(15 - 25°C)。

1. 小心地使用移液器将密度梯度离心液加入到SepMate™插件的孔中。密度梯度离心液会没过插件上方。所需体积请参阅表 1。

注意:移液后密度梯度离心液中可能存在小气泡,这些气泡不会影响性能。
SepMate™管 初始样品体积(mL) 密度梯度离心液体积(mL)
SepMate™-15 0.5 - 4 4.5
SepMate™-15 4 - 5 3.5
SepMate™-50 4 - 17 15.0
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2. 用等体积的PBS + 2% FBS溶液稀释样品(例如,用5 mL PBS + 2% FBS溶液稀释5 mL样品),并轻轻混合。

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3. 保持SepMate™管垂直,沿着管壁将稀释的样品加到管中。样品将与插件上方的密度梯度离心液混合。

注意:不要通过中心孔直接倒入稀释的样品。

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4. 在室温下以1200 x g 离心10分钟(打开离心机刹车)。对于超过 24 小时的样品,建议离心时间为20分钟。

注意:不同品牌和型号的离心机在打开刹车时的减速效果可能不同。如果离心后看不到一层MNCs或MNCs的回收率较低,请将减速(即刹车)速率降低至中或低。

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5. 将含富集有MNCs的上层溶液倒入新管中。请勿将SepMate™管倒置超过2秒。

注:离心后,SepMate™插件表面可能存在一些红细胞 (RBCs)。这些红细胞不会影响性能;为了减少富集的MNCs中的血小板污染,请在倾倒之前吸走MNC层上方的一些上清液。

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6. 用PBS + 2% FBS溶液清洗富集的MNCs,并重复清洗。建议在室温下以300 x g离心8分钟,并打开刹车。

7. 若要从富集的MNCs中去除血小板,请在室温下以120 x g进行一次10分钟的清洗,并关闭刹车。

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